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非洲猪瘟PCR检测实验室建设方案参考

层流科技 / 2020-10-17 22:07:35

非洲猪瘟PCR检测实验室建设方案参考

 

非洲猪瘟病毒在入侵中国以来,中国的生猪产业链各个环节都受到很多影响,非洲猪瘟检测实验室的设计建设迫在眉睫。

 

首先,生猪生产企业需要建立标准化的非洲猪瘟检测实验室。通过检测猪的血清或唾液或环境土壤来判断非洲猪瘟是否感染,通过猪场生物安全管理来截断非洲猪瘟传播,为猪场的顺利生产提供安全保障。

 

其次,定点屠宰企业需要建立标准化的非洲猪瘟检测实验室。通过屠宰场场外检测,排除非洲猪瘟感染的生猪进入场内,通过屠宰企业内部实验室检测防止有非洲猪瘟感染的猪肉流入市场,检测加工好的肉制品或分割肉来防止肉类加工食品流入市场,避免企业受到不可估量的经济损失。

 

第三,各级畜牧局需要建立标准化的非洲猪瘟检测实验室,来加强生猪养殖企业、生猪屠宰企业的管理,加强非洲猪瘟的防控。

 

第四,肉类加工企业需要建立标准化的非洲猪瘟检测实验室。肉类加工企业,只要需要猪肉就需要检测进场猪肉的非洲猪瘟检测项目,防止有感染非洲猪瘟的肉品流入企业生产线,防止生产线被非洲猪瘟病毒污染,保障企业的利益不受影响。


 

一、什么是PCR实验室 

PCR 是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的简称。聚合酶链式反应也可以 当作一项极其重要的酶促合成 DNA 技术。PCR 又称为无细胞克隆系统或特异性 DNA 序列体外引物定向酶促扩增法,是基因扩增技术的一次重大革新,它可将极微量的靶 DNA 特异地扩增上百万倍。

聚合酶链反应(PCR)是在 DNA 聚合酶催化下,以母链 DNA 为模板以特定引物为延伸起

点,通过变性、退火、延伸等步骤,体外复制出与母链模板 DNA 互补的子链 DNA 的过程。是 一项 DNA体外合成放大技术,能快速特异地在体外扩增任何目的 DNA。可用于基因分离克隆,序列分析,基因表达调控,基因多态性研究等许多方面。

一对合成 DNA 的引物经过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过 30 次循环,最终使基因放大了数百万倍将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的 DNA 带。

 

 

 

二、PCR实验室设计原则:

1非洲猪瘟检测实验室的选址

符合国家检测实验室的相关规定,具体适用于屠宰场来说,可选择办公楼或者独立的实验室空间,选绝对不能和屠宰线通,如果实验室阳性对照污染,会污染整个屠宰生产线,势必对屠宰场造成巨大的经济损失。

个别不专业的实验室设计建造公司因为不了解非洲猪瘟检测实验室的检测流程,造成设计布局不合理,对后期开展工作造成很大的不便及生物安全隐患。

2、主体结构: 

目前实验室的主体多为彩钢板、铝合金型材。室内所有阴角、阳角均采用铝合金R50内角铝,从而解决容易污染、积尘、不易清扫等问题。并且彩钢板结构牢固,线条简明,美观大方,密封性好。

3、标准的四区分隔和气压调节: 

 PCR 过程分成试剂准备、标本制备和 PCR 扩增区及产物分析检测区四个独立的实验区。整个区域有一个整体缓冲走廊。每个独立实验区设置有缓冲区,同时各区通过气压调节, 使整个 PCR 实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染并降低扩增产物对人员和环境的污染。 

另外: 

PCR 实验室根据使用仪器的功能合理设置各个工作区域,如采用聚合酶联反应:则设置试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区四个单独的工作区域,这是最

常用的分区方式。样品需要粉碎处理的,还需增设样品粉碎区;若使用实时荧光 PCR 法:基因扩增区、基因产物分析区可以合并在一个房间内;采用标本处理、核酸提取及扩增检测为一体的全自动化 PCR 分析仪,则标本制备区、扩增区、扩增产物分析区可合并为一个区域,因此 PCR 实验室原则上设置五个区或四个区或三个区或二个单独的工作区。

 

核酸扩增前区和核酸扩增后区可设在一个房间内,但必须在满足下列要求的前提下:

a. 核酸扩增前区实验室内设置两个不同位置的实验区,试剂配置在超净工作台中操作,样品处理在生物安全柜内操作。

b. 在核酸扩增后区使用全封闭的扩增和检测系统,如实时荧光 PCR 仪等。

c. 每个实验人员使用各自的试剂、耗材、移液器和盛放污染物的盛器。

d. 在实验前后对操作区域和共享器具进行清洁及消毒。

e. 各区域的试剂、器具、仪器和设备为该区专用,不得交叉使用。

4非洲猪瘟检测实验室的布局:

非洲猪瘟检测实验室用的仪器为荧光定量PCR,因此核酸扩增和分析在一个区,实验室设计需要如下功能房间:PCR缓存走廊、带缓存间的配液室、带缓存间的样品处理室、带缓存间的核酸扩增分析区及实验室用具消毒室。

5非洲猪瘟检测实验室生物安全保护:

理论上讲非洲猪瘟检测实验室是BSL-2 生物安全实验室,需要配置二级生物安全柜,推荐选择70%外排,30%内循环,各功能房间缓存设置更衣柜和消毒器,各区的实验服专用,物料流通需要配置带紫外线的互锁的传递窗,实行人流物流分开设置。

6非洲猪瘟检测实验室消毒: 

在三个实验区和三个缓冲区顶部以及传送窗内部安装有紫外灯,供消毒用。

在试剂准备区和标本制备区还设置移动紫外线灯,对实验桌进行局部消毒。

7非洲猪瘟检测实验室机械连锁不锈钢传递窗: 

试剂和标本通过机械连锁不锈钢(不建议使用电子连锁方式)传递窗传递,保证试剂和标本在传递过程中不受污染(人物分流)。

8非洲猪瘟检测实验室地面

地面建议使用 PVC 卷材地面或自流坪地面,整体性好。便于进行清扫,耐腐蚀。没有条件的也可采用水磨石地面,或大块的瓷砖(至少 800mm×800mm)接缝需要小于 2mm

9非洲猪瘟检测实验室照明 

灯具要选用净化灯具,能达到便于清洗、不积尘的特点。

 PCR实验室布局

 

 PCR走廊及缓存间

 

 

 传递窗及观察窗

 

三、空气流与压差要求

PCR 实验室的空气流向必须严格按照试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区空气压力逐渐递减方式进行,防止扩增产物顺空气气流进入扩增前的区域。风速流向不得混乱。

为了保证房间内的压差和避免污染,应在空调面板处写清楚送风机和排风机的开启顺序和关闭顺序,先后顺序不得混乱。

空气洁净级别不同的相邻房间之间的静压差应大于 5 帕,洁净室()与室外大气的静压差应大于 10 帕,应配备监测静压差的设备,并定期监控。

 

一般情况下,试剂配制室及样品处理室宜呈微正压,以防外界含核酸气溶胶的空气进入,造成污染;可以通过控制进风风量大于排风风量达到正压效果。

核酸扩增室及产物分析室应呈微负压,以防含核酸的气溶胶扩散出去污染试剂与样品,可以通过控制排风风量大于进风风量达到负压效果。

在理想情况下,PCR 实验室缓冲间内,可设置正压,使室内空气不流向室外,室外空气不流向室内。PCR实验室进风由原有中央空调控制的要求将中央空调风口安装到指定定点。

四、实验室设施要求:

实验室基础设施设计:包括实验室基础装修、实验室净化工程、实验室供排水工程、实验室电路系统。

1实验室基础装修需要洁净天花、地板、隔断,合理设置缓存间及配置净化门、观察窗、传递窗等。

2实验室净化工程 实验室应配备单独送排风设施,试剂配置区、核酸提取区和扩增分析区应配备净化系统。

3实验室供排水工程包括非手动水龙头、不锈钢或PP水池和紧急淋浴器及供排水管线管路。

4实验室电路系统:根据仪器的功率配置合适的功率,特别注意高压灭菌锅的功率,注意实验室用电安全。

5配备适用的应急器材,如应急照明设备、消防器材、意外事故处理器材等。

 

五、实验室仪器及设备

 

1)更衣室仪器及设备:更衣柜或挂衣架、鞋柜以及消毒器和烘干器。

2)配液室仪器及设备:佰伦超净工作台、冰箱、小型离心机、旋涡振荡器、微量移液器等。

3)样品处理室仪器及设备:离心机、组织研磨机、级生物安全柜、恒温水浴锅、冰柜等、可移动紫外消毒器。

4)核酸提取室仪器及设备:核酸提取仪、级生物安全柜、恒温水浴锅、小型离心机、微量移液器、可移动紫外消毒器等。

5)扩增分析区仪器及设备:荧光定量PCR仪、电脑、打印机、不间断电源、可移动紫外消毒器等。

6)消毒洗涤室:高压灭菌器、干燥箱、器皿柜等。

(一般配置参考)

 

实时荧光定量PCR

生物安全柜

超净工作

 

 

六、实验室面积及设备间距 

一般来说各房间的面积没有严格要求,只需能放置所需仪器设备,并且便于人员操作即可,但是有生物安全柜的房间面积不能小于10平米,并且每增加一台生物安全柜,房间就要增加 10 平米。各实验室缓冲间的面积一般为 1300*1300 或 1500mm 为宜,并且缓冲间的面积不能 大于实验室房间面积的 1/8

在做平面设计的时候,首先要考虑的因素是就是“安全”,实验室是最易发生爆炸、火灾、毒气泄露等的场所。我们在做平面设计的时候,应尽量地要保持实验室的通风流畅、逃生通道畅通。根据国际人体工程学的标准。

我们做如下的划分以供参照:

实验台与实验台通道划分标准(通道间隔用 表示)

L>500mm 时,一边可站人操作;

L>800mm 时,一边可坐人操作;

L>1200mm 时,一边可坐人,一边可站人,中间不可过人;

L>1500mm 时,两边可坐人,中间可过人;

L>1800mm 时,两边可坐人,中间可过人可过仪器

天平台、仪器台不宜离墙太近,离墙 400mm 为宜。为了在工作发生危险时易于疏散,实验台间的过道应全部通向走廊。另:实验室建筑层高宜为 3.7 -4.0 米为宜,净高宜为2.7米-2.8 米,有洁净度、压力梯度、恒温恒湿等特殊要求的实验室净高宜为 2.5 -2.7 米(不包括吊顶);实验室走廊净宽宜为 2.5 米-3.0 .普通实验室双门宽以 1.1 -1.5 (不对称对开门)为宜,单门宽以 0.8 -0.9 米为宜。

七、洁净装修要求

洁净室(区)的内表面应平整光滑、无裂缝、接口严密、无颗粒物脱落,并能耐受清洗

和消毒,墙壁与地面的交界处宜成弧形或采取其他措施,以减少灰尘积聚和便于清洁。

洁净室()内各种管道、灯具、风口以及其他公用设施,在设计和安装时应考虑使用中

避免出现不易清洁的部位。

洁净室()的窗户、天棚及进入室内的管道、风口、灯具与墙壁或天棚的连接部位均应

密封。

八、人流路径与物流路径 

进入实验室区域工作人员应该按照以下路径:

公共清洁区——更衣间(更换洁净服)——缓冲间——污染实验区

工作人员退出实验室的路径为:

污染试验区——缓冲间——淋浴间(有条件的可设置)——更衣间——公共清洁区

所有的物品进入实验区必须经过双扉互锁传递窗,利用传递窗消毒后才可进入,实验室

内所有物品的也必须经过传递窗才可以传递到实验室以外的清洁公共区。

门的开启方向

实验室建筑层高宜为 3.7 -4.0 米为宜,PCR 实验室净高宜为 2.5 -2.7 米(不包括吊顶);实验室走廊净宽宜为 2.5 -3.0 .普通实验室双门宽以 1.1 -1.5 (不对称对开门)为宜,单门宽以 0.8 -0.9 米为宜。

一般实验室门主要向里开,但如有危险的房间,房门应朝外开,房门材质最好选择压力

玻璃。

有压差梯度的房间,门的开启方向应朝向正压方向一侧开启;

考虑到消防安全,对于那些主要逃生门的开启方向应朝向清洁区方向开启。

九、工作服要求

在净化车间内工作的人员应穿着符合要求的工作服。工作服的选材、式样及穿戴方式应与生产操作和空气洁净度级别要求相适应,并不得混用。洁净工作服的质地应光滑、不产生静电、不脱落纤维和颗粒性物质。无菌工作服必须包盖全部毛发、胡须及脚部,并能阻留人体脱落物。不同空气洁净度级别使用的工作服应当分别清洗、整理,必要时消毒或灭菌。工作服洗涤、灭菌时不应带入附加的颗粒物质。工作服应制定清洗周期。

进入各个区域必须严格按照单一方向进行,不同的工作区域使用不同的工作服(例如不同的颜色)。工作人员离开时,不得将工作服带出。

实验室应建立、执行人员进出洁净区的清洁程序和管理制度,人员清洁程序合理。

十、人员培训

配备至少两名专业实验员,能够独立处理样品、提取核酸及核酸扩增,熟练掌握超净工作台、生物安全柜、自动提取仪、实时荧光定量PCR的使用,加强生物安全方面的培训,避免实验室污染。

 

 

附:非洲猪瘟检测实验室要求参考

一、非洲猪瘟

   非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起猪的一种急性、热性、高度接触性动物传染病,临床上以高热、网状内皮系统出血和高死亡率为特征,易感猪群的病死率高达100%。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病,我国将其列为一类动物疫病。目前,针对非洲猪瘟防控,尚无有效的商品化疫苗,防控重点是做好生物安全管理和早期诊断扑杀净化。

 

二、非洲猪瘟感染规律

   源于:《FAO动物生产与卫生手册——非洲猪瘟:发现与诊断》

   ASF自然感染潜伏期为4-19天。

   最急性和急性感染通常在4-10天死亡。

   在临床症状出现的2天前,ASF感染动物开始散播大量病毒。

   感染后7-9天血清转阳,抗体持续很长时间,可持续终生。

三、非洲猪瘟检测方案

1、荧光定量PCR检测方案

2、非洲猪瘟病毒抗原快速检测试纸

四、非洲猪瘟检测实验室设备仪器配置方案

   用于非洲猪瘟病毒检测的实验室,推荐配置以下设备:II级生物安全柜、混匀仪(涡旋振荡器)、高速离心机、金属浴或恒温水浴锅、组织破碎仪(均质器/匀浆仪)、移液器、冷藏冷冻冰箱、高压灭菌锅。同时,建议实验室配备合适的个人防护用品,如防护服、手套、口罩等。

 

    1. II级生物安全柜:提供无菌环境用于处理组织样品等(避免外部环境污染样品),同时保证病毒不向实验室环境扩散(保证人员和环境安全)。

 

    2.高速离心机:用于血清的分离和样品的处理的分离。

    3. 金属浴或恒温水浴锅:提供恒温环境,用于样品处理过程中的裂解过程。建议选择带有震荡功能的设备,或者配备单独的混匀仪(涡旋振荡器)。

    4.组织破碎仪(均质器/匀浆仪):根据样品类型选择便携式组织破碎仪或者高通量组织破碎仪等(在用组织检测时使用)。

    5. 移液器:用于实验过程中的微量体积加样。

    6.冷藏冷冻冰箱:用于样品、试剂盒试纸等储存,建议定期监测冰箱温度。

    7.高压灭菌器:用于实验结束后样品及用具的灭菌处理,避免样品带有病毒时泄露导致疫情扩散。

 

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